H5亞型禽流感(如H5N1)是一種全世界范圍的人畜共患病,嚴(yán)重威脅著家禽產(chǎn)業(yè)以及人類的公共健康。對(duì)禽流感病毒進(jìn)行及時(shí)、定量和亞型檢測(cè),是快速診斷和疾病防控的重要基礎(chǔ)。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),尤其是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),使核酸擴(kuò)增可以在恒溫條件(60-65 °C)下進(jìn)行,是對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的重要改進(jìn),尤其適用于條件欠發(fā)達(dá)地區(qū)以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),通過(guò)將反應(yīng)體系分隔為大小均一的大量反應(yīng)單元,進(jìn)行獨(dú)立的單拷貝等溫?cái)U(kuò)增,并基于泊松分布,對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì),在準(zhǔn)確性、靈敏度和絕對(duì)定量(不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線)方面有了革命性的改進(jìn),尤其適用于病毒載量的定量檢測(cè)。因而,開(kāi)發(fā)適用于禽流感檢測(cè)的數(shù)字LAMP技術(shù)具有重要意義。

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所杜文斌課題組最近研發(fā)了一種界面打印液滴生成方法(Cross-interface Emulsification, XiE)(Xu et al., 2016, Anal. Chem. 88:3171-3177)。其原理是利用穩(wěn)定流速注射液體的毛細(xì)管在油-氣界面處的高頻振動(dòng),利用在油-氣界面的表面張力的周期性切割作用,實(shí)現(xiàn)均一液滴的制備。通過(guò)該方法,可快速連續(xù)生成大量皮升至納升體積微液滴,平鋪于96孔板容器底部形成液滴陣列。XiE技術(shù)不依賴于微加工技術(shù),成本低、操作自動(dòng)化程度高,非常適合于實(shí)現(xiàn)數(shù)字核酸擴(kuò)增分析。

前期的研究中,對(duì)基于XiE的數(shù)字等溫LAMP擴(kuò)增進(jìn)行了初步研究,表明這一系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的核酸定量檢測(cè)。在前期工作的基礎(chǔ)上,與中科院動(dòng)物研究所研究員何宏軒課題組合作,針對(duì)H5亞型的禽流感病毒的快速定量檢測(cè),開(kāi)展了模型驗(yàn)證和禽流感真實(shí)樣品的檢測(cè)。建立了特異性的H5亞型禽流感病毒LAMP檢測(cè)引物探針,首次驗(yàn)證了數(shù)字LAMP用于H5禽流感病毒檢測(cè)的特異性、靈敏度和線性范圍。

研究結(jié)果表明,數(shù)字LAMP與實(shí)時(shí)熒光定量PCR,以及美國(guó)伯樂(lè)公司的QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度和線性一致,具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。值得指出的是,相比于數(shù)字PCR和熒光定量PCR,數(shù)字LAMP表現(xiàn)出更好的抗抑制劑能力(如腐植酸、SDS等),可以保證方法對(duì)沒(méi)有充分除去污染物的野外或臨床樣品檢測(cè)的可靠性。

該課題得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的支持(2016YFC0100900),相關(guān)研究成果已經(jīng)在線發(fā)表在《分析化學(xué)》(Analytical Chemistry)上。何宏軒課題組的博士后胡奕和杜文斌課題組的徐鵬為該文章的共同第一作者。

來(lái)源：微生物研究所